“血红蛋白的提取和分离”的实验分析及教学组织

概要：2HPO4溶液 将71．64 g 的Na2HPO4·12H20充分溶解于1000 mL的蒸馏水中 在混合两种溶液时，注意用酸度计或pH试纸检测，并调节溶液的pH在7．0左右 ② 0．2mol/L的 NaH2PO4溶液 将 31．21 g 的NaH2PO4·2H20充分溶解于1000 mL的蒸馏水中充分溶解 ③ pH约为7．0的20mmol/L磷酸缓冲液

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2HPO₄溶液 将71．64 g 的Na₂HPO₄·12H₂0充分溶解于1000 mL的蒸馏水中 在混合两种溶液时，注意用酸度计或pH试纸检测，并调节溶液的pH在7．0左右 ② 0．2mol/L的 NaH₂PO₄溶液 将 31．21 g 的NaH₂PO₄·2H₂0充分溶解于1000 mL的蒸馏水中充分溶解 ③ pH约为7．0的20mmol/L磷酸缓冲液 取61 mL步骤①中配制的Na₂HPO₄溶液与39 mL步骤②中配制的NaH₂PO₄溶液混合   3．1．2 丙烯酰胺和N, N-甲叉双丙烯酰胺的配制及注意事项   将29 g丙烯酰胺和1 g N, N-甲叉双丙烯酰胺溶于总体积为70 mL的水中，搅拌过夜使之充分溶解。注意事项：丙烯酰胺和双丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，因此，操作时需要戴上手套和防毒面具，而且在通风橱内或通风处进行。价格较低的这两种药物中含有一些金属离子，为除去这些金属离子，可以在丙烯酰胺溶液中加入大约0．2倍体积的单床混合树脂，搅拌放置一夜后，再用Whatman 1号滤纸过滤就可以纯化。储存期间，由于光或碱的催化作用，丙烯酰胺和双丙烯酰胺会缓慢转化成丙烯酸和双丙烯酸，因此，应将配制好的溶液置于棕色瓶中，置于4 ℃保存，并且使用前应检查该溶液的pH，以确保pH不超过7．0。   3．1．3 SDS的配制及注意事项   将SDS用去离子水配制成10%的贮存液，于室温保存。注意事项：市售的SDS化学纯度不够，需要重结晶后使用。重结晶方法如下：称取20 g SDS,放入500 mL圆底烧瓶中，加半勺活性炭及300 mL无水乙醇，搅拌，摇匀。烧瓶上接一个小冷凝管。在水浴上加热至乙醇微沸，回流约10min，用热过滤漏斗趁热过滤。滤液应透明无色。滤液冷却至室温后，移至-20 ℃过夜。第二天，通过预冷的布氏漏斗抽滤，用少量-20 ℃无水乙醇洗沉淀3次，尽量抽干，将结晶置真空干燥器中干燥或40 ℃烘箱中烘干。   3．2 凝胶色谱柱的制作和装填   3．2．1凝胶色谱柱的制作   取长100cm，内直径1．6cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。底塞打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，导致蛋白质分离不彻底。   3．2．2凝胶色谱柱的装填   计算并称取一定量的交联葡聚糖凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。将色谱柱装置固定在支架上，将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，凝胶沉集后，将溶剂放出至胶面不再下降，并且通过2～3倍柱床体积的溶剂（20mmol/L的磷酸缓冲液，pH 7．0）使柱床稳定。装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300 mL的20mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7．0）充分洗涤平衡12h。注意事项：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙；装填凝胶柱时不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果；液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动，从而影响生物大分子物质的分离效果；注意不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。   4.实验操作步骤及注意事项   本课题的主要目的是运用凝胶色谱法对蛋白质进行分离纯化，以下是实验操作流程。

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  样品的处理：取家兔一只，为保证取血量，取其颈动脉血，按1:1加入抗凝剂肝素（1250U/ mL）或适宜浓度的柠檬酸钠溶液（将6ｇ柠檬酸钠溶于100 mL的生理盐水中），若要过夜，温度须控制在4 ℃左右。在样品处理的流程中，第一步用到低速离心，而第三步用到高速离心，这主要是因为血液中除有红细胞外，还有其他细胞及大量的物质，红细胞与这些物质之间的密度存在较大的差异，用低速离心就能将他们分离开；而“分离血红蛋白溶液”步骤中，溶液的主要成份的密度相对要接近些，因此需要用较高速的离心，才能将这些物质初步分离。   搅拌好的混合液离心后明显分为4层（如右图），由上至下依次是甲苯层、脂溶性物质的沉淀层、血红蛋白的水溶液、红细胞破碎物沉淀。取其上清液，用滤纸过滤除去脂类，再使滤液在分液漏斗中静置5min，出现分层，分离出下层的血红蛋白溶液。   粗分离：将血红蛋白溶液装入规格为7000D的透析袋，按1:300的比例放入20mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH为7．0），透析12h。透析的目的一是为了除去小分子蛋白质，二是使血红蛋白处于缓冲液环境中，便于后续的磷酸缓冲液在凝胶柱中进行洗脱。   纯化：可采用柱型为Sephadex G75，柱体积为500 mL的色谱柱；加样量为10 mL（约含蛋白200 m g）；用20mmol/L的磷酸盐缓冲液（pH为7．0）进行洗脱，洗脱速度可控制为0．5 mL /min，即20 min /管。此时可用A280的紫外线进行检测，如果测得的数值很高，说明蛋白含量过高，此时需要进行稀释。下图是将每管取0．5 mL稀释10倍后，用紫外线测量的结果（如下图）。      由图中数值可知，33-38管对应的数值为血红蛋白的吸收值，选择此时的试管进行蛋白质纯度的鉴定是比较合适的。   纯度鉴定：经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定，以下是实验操作流程。  

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